Stáže

Department of Medical Biosciences, Umea University, Švédské království

Informujeme o realizovaných stážích s podporou projektu IntegRECAMO: Intellectual anchor, dále o stážích uskutečněných od 1.7.2015 v rámci udržitelnosti projektu IntegRECAMO: Intellectual anchor a financovaných z jiných zdrojů.

2018

Biomedicínské centrum SAV, Ústav experimentální onkologie, Bratislava, Slovenská republika

Ve dnech 1.6.-27.8.2018 se Mgr. Michal Pastorek, Ph.D. zúčastnil pracovní stáže na Biomedicínském centru SAV, Ústavu experimentální onkologie, za účelem prohloubení kvalifikace a navázání možné spolupráce v oblasti práce s myšími modely karcinomu prsu. Náplní práce pod odborným vedením pracovníků Oddělení molekulární onkologie bylo pomocí subkutánního podání nádorových buněk karcinomu prsu vytvořit funkční model nádoru na SCID myších. Na vytvořeném modelu by bylo možné následně testovat aplikaci fluorescenčně značené protilátky anti-Hsp90 EEV 1.2.1., která byla připravená na pracovišti RECAMO.

Department of Medical Biosciences, Umea University, Švédské království

 

2017

MRC Institute of Genetic and Molecular Medicine, Edinburgh, Velká Británie

V období 4.11. – 20.11.2017 absolvovala Mgr. Pavlína Zatloukalová, Ph.D. stáž v “MRC Institute of Genetic and Molecular Medicine” v Edinburghu, ve Skotsku. V průběhu stáže byly připraveny buněčné linie nesoucí knockoutovaný transkripční faktor ID4. Linie byly připravený pomocí CRISPR technologie a budou dále využity v RECAMO k objasnění mechanismu účinku látky LAQ824, která má schopnost inhibovat enzymatickou aktivitu histonových deacetyláz, čímž způsobuje rozvolnění terciární struktury chromatinu a umožňuje přístup transkripčních faktorů. LAQ824 bude na těchto liniích testováno a získaná data budou dále využitá při připravě publikace.

Department of Medical Biosciences, University of Umeå, Umeå, Švédské království

Vobdobí 7.6. – 30.8.2017 absolvovala Mgr. Veronika Brychtová, Ph.D.stáž na oddělení “Department of Medical Biosciences” na univerzitě v Umeå, ve Švédsku. Náplní pracovní stáže bylo zapojení se do probíhajících projektů zaměřených na i) analýzu nukleotidových variant (SNV) v genomu mladého pacienta s karcinomem jazyka a přilehlých oblastech, a ii) změna exprese genů MUC1 a IFI27 v nádorové a přilehlé nenádorové tkáni u pacientů s karcinomem jazyka. Součástí experimentální práce bylo osvojení si a získání praxe s laboratorními technikami, jako je pyrosekvencování a laserová mikrodisekce (LCM), přičemž metoda LCM bude následně využívána pro projekty probíhající na odělení RECAMO. Kromě uvedeného se V. Brychtová na oddělení “Chemical Biological Centre” seznámila s technikou elektronové mikroskopie. Provedené experimenty a data získaná v průběhu stáže budou zhodnocena v rámci připravovaných publikací. Pracovní stáž byla přínosná z hlediska rozšíření instrumentálního/metodického a teoretického zázemí, které bude následně využíváno v další vědecké práci. Současně byly rozšířeny možnosti vzájemné spolupráce mezi naším oddělením a “Department of Medical Biosciences” v Umeå.

Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), Institut de Génétique Moléculaire, Paris, France

V termínu 1. 4. – 30. 9. 2017 absolvovala Mgr. Lucia Hároníková, Ph.D. stáž v laboratoří dr. Fahreus z Equipe Labellisée la Ligue Contre le Cancer, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale UMR1162, Institut de Génétique Moléculaire, Université Paris 7, Hôpital St Louis, Paris, France. Cílem pracovní cesty bylo prohloubení spolupráce a zaučení do metodiky na probíhajících vědeckých projektech. Pracoviště se dlouhodobě věnuje problematice onkologicky významného proteinu p53 s jeho interakčními partneři, zejména proteinem HDM2, HDMX a také interakce proteinu p53 s různými mRNA. V návaznosti na zkoumané tématiky měla L. Hároníková možnost naučit se metodu ELISA RNA a touto metodou stanovovat vazebné vlastnosti proteinu HDM2 k p53 mRNA. Získané výsledky budou použity pro analýzu této vazby pomoci HDX hmotnosti spektrometrie na pracovišti RECAMO. Byl taktéž prozkoumáván vliv proteinu p53 po vazbě k cílovým RNA. Tyto interakce byly zkoumané pomocí metod PLA (proximity ligation assay) v buněčných liniích H1299 a HCT116 a pomoci metody RNA koimunoprecipitace s následní analýzou pomoci qPCR. Pracovní cesta byla prospěšná pro rozvinutí další spolupráce s pracovištěm dr. Fahreuse.

IGMM, University of Edinburgh, Edinburgh, Velká Británie

V termínech 5.9. - 1.12.2016 a 31.1. - 30.4.2017 absolvoval Mgr. Filip Trčka, Ph.D. pracovní stáž na IGMM University of Edinburgh za účelem obohacení dosavadních znalostí v oblasti protein-proteinových interakcí chaperonového systému a transkripční odpovědi buněk vystavených proteotoxickému stresu. Prováděné experimenty byly zaměřeny na studium podmínek in vivo fosforylace proteinu Tomm34 a jeho interakce s proteiny rodiny 14-3-3. Dále byla prováděna analýza aktivace proteinu HSF1 v podmínkách proteotoxického stresu vyvolanému inhibicí proteasomu. Byly získány rozsáhlé poznatky o kinetice a dynamice aktivace transkripčního faktoru HSF1, které budou základem pro připravovanou publikaci popisující "intimní" spojení mezi aktivací HSF1 a mírou proteosyntézy. Dále byla determinována stabilita proteinu IRF1 v přítomnosti inhibitoru Hsp90 a na analýza peptidových motivů interagujících s chimerickými molekulami inteferonů pomocí metody phage display. V průběhu stáže se podařilo navázat řadu vzájemně prospěšných spoluprácí, které umožnily propojení experimentálních a instrumentálních postupů prováděných na našem pracovišti a na IGMM Edinburgh. Mezi tyto patří zejména analýza buněčné polysomální frakce pomocí ultracentrifugace buněčného lyzátu v sacharózovém gradientu. Pomocí této metody se podařilo odhalit "systemickou" translační regulaci v buňkách s inhibovaným proteasomem.

2016

IGMM, University of Edinburgh, Edinburgh, Velká Británie

viz výše.

 

Centre Eugene Marquis, Université de Rennes, Rennes, Francie

V termínu 15.5. – 15.8.2016  absolvovala Mgr. Lucia Sommerová stáž ve výskumné skupině Oncogenesis, Stress and Signalling v Centre Eugene Marquis, Université de Rennes 1 v Rennes, Francii. Pracovní stáž byla finančně podpořena stipendiem uděleným Metropole Rennes na podporu mobility zahraničních Ph.D. studentů.Hlavní náplní stáže byla funkčná analýza interakce AGR2 a ERp57, která byla zjištená na pracovišti RECAMO. Náplní práce bylo stanovení vlivu umlčení jedného z interakčních partnerů na intracelulární a extracelulární expresi druhého interakčního partnera. Zároveň se Mgr. Sommerová zaměřila na charakterizaci povahy této interakce, presneji zda se jedná o interakci cystein-dependentní. Využila k tomu plazmidy exprimující mutantní formy proteinu AGR2.
Druhým projektem, ke kterému se Mgr. Sommerová měla možnost připojit během pracovní stáže, byl projekt zabývající se dimerními a monomérními formami proteinu AGR2 za fyziologických podmínek a podmínek stresu endoplazmatického retikula. V rámci tohto projektu zkoumala vliv, který mají jednotlivé formy AGR2 na expresi a membránový transport klientských proteinů AGR2. K práci využila molekulárně biologické a biochemické metody, pomocí kterých připravovala transfekované buněčné línie exprimující vždy jen jednu z forem proteinu AGR2. Využitím imunofluorescnece a flowcytometrie analyzovala expresi a lokalizaci klientského proteinu CD59 v buňce. 
 

2015

Department of Microbiology, Tumor and Cell Biology, Karolinska Institutet, Stockholm, Švédsko

V období 1. 11. 2015 – 30. 4. 2016 absolvovala Mgr. Marta Nekulová, Ph.D. šestiměsíční stáž ve skupině Prof. Sonii Lain na Karolinska Institutet ve Stockholmu. Tato výzkumná skupina se dlouhodobě zabývá studiem látek aktivujících protein p53 a vykazujících protinádorové účinky. Její členové se věnují screeningu rozsáhlých knihoven nízkomolekulárních látek pomocí různých metod molekulární a buněčné biologie (enzymatic assays, p53 reporter assay, sulforhodamine B colorimetric assay, clonogenic survival assay) a následné charakterizaci molekul, které selektivně snižují viabilitu nádorových buněk a mají minimální účinek na lidské fibroblasty. Aktuálně se zaměřují zvláště na nízkomolekulární inhibitory enzymu dihydroorotát dehydrogenázy (DHODH), který je vysoce aktivní v nádorových buňkách. Tento projekt probíhá ve spolupráci se švédskou organizací The SciLifeLab Drug Discovery and Development platform, která se zaměřuje na přenos poznatků základního výzkumu do klinické praxe (pre-clinical proof-of-concept). Výsledky tohoto výzkumu byly publikovány v prestižních časopisech a jsou i předmětem patentové ochrany.
V rámci své stáže se Dr. Nekulová seznámila se všemi metodami dostupnými v laboratoři Prof. Lain a také s postupy při vývoji nových nízkomolekulárních léčiv s protinádorovým účinkem. Podílela se na testování účinnosti nové generace inhibitorů na panelu melanomových linií a na výzkumu úlohy proteinů p53 a p14arf v buňkách melanomu. Dr. Nekulové se podařilo také charakterizovat nově připravené monoklonální protilátky proti DHODH a s jejich pomocí srovnat hladinu tohoto enzymu u různých typů nádorových buněk a lidských fibroblastů.
Ve spolupráci se skupinou Prof. Lain bude Dr. Nekulová pokračovat i po návratu do České republiky, a to zvláště v oblasti využití knihoven systému CRISPR/Cas9 pro charakterizaci vybraných nízkomolekulárních inhibitorů.
 

A*STAR Bioinformatics Institute, Singapore

V termínu 23. 11. - 8. 12. 2015 se MUDr. Petr Muller, Ph.D. zúčastnil pracovní cesty do Singapuru, kde jako stážista pracoval na Biomedical Science Institut (BMSI) A*STAR, v laboratoři prof. D. Lanea. Ve dnech 25.11.-27.11. se zúčastnil konference „Exploring Mechanisms in Biology: Theory and Experiment“ pořádané Bioinformatics Institute (BII) A*STAR, kde prezentoval práci "Clustering of short peptide sequences to identify protein-interaction consensus motifs in large datasets". V rámci stáže prezentoval výsledky pracoviště RECAMO v oblasti editace genomu a jeho využití pro racionální vývoj léků a objasnění mechanismu účinku biologicky aktivních látek. Během stáže se podrobně seznámil s projekty zaměřenými na 1) vývoj terapeutických látek na bázi peptidů (stapled peptide), 2) aktivaci p53 negenotoxickými látkami, 3) vývoj rekombinantních protilátek přímým klonováním variabilních řetězců imunoglobulinu ze selektovaných lymfocytů. Výsledkem stáže bude do budoucna i prohloubení spolupráce na projektech RECAMO spojených s aktivací p53 nádorech, hledání nových terapeutických přístupů a využití CRISPR nukleáz k farmakogenomickému výzkumu.

A*STAR Bioinformatics Institute, Singapore

Ve dnech 13.11. - 15. 12. 2015 Mgr. Adam Krejčí působil v institutu A*STAR Bioinformatics Institute v Singapuru jako stážista ve skupině Dr. Chandry Vermy. Stáž byla zaměřená na problematiku modelování proteinů a jejich interakcí s použitím výpočetních technik molekulové dynamiky. Po seznámení se s problematikou molekulového modelování ve spolupráci s členy týmu (především Dr. Verma a Dr. Dilraj Lama) pracoval na simulacích interakcí různých peptidů s terapeutickou protilátkou Rituximab. Ačkoliv je tato protilátka již delší dobu využívána v klinické praxi, není zcela jasné, jakým způsobem se k cílovému proteinu CD20 na povrchu buněk váže. Články na toto téma podávají rozporuplné výsledky. V rámci výzkumu v RECAMO byl s využitím metod screenování peptidových knihoven již dříve objeven peptid, který se pravděpodobně na protilátku váže. Během stáže Mgr. Krejčí nejdříve využil metod tzv. Dockování pro nalezení možných vazebných míst pro tento peptid na povrchu protilátky a konformací, ve kterých se peptid může vázat, načež jsem simuloval peptid navázaný na protilátce s využitím metod molekulové dynamiky a odvodil intenzitu této interakce. Stejným způsobem simuloval jiný peptid, dříve v literatuře zmíněný jako cíl rozpoznávaný protilátkou a následně jsem porovnával vypočtené intenzity interakcí. Vzhledem k velké výpočetní náročnosti metod molekulové dynamiky se v současné době čeká na výsledky některých možných vazebných konformací. Do budoucna je v plánu z uskutečněných výpočtů dále odvodit, které aminokyseliny nalezeného peptidu jsou pro vazbu nejdůležitější a následně experimentálně ověřit platnost vypočtených výsledků. Tato práce již bude probíhat na RECAMO.

V rámci stáže se Mgr. Krejčí dále ve dnech 25.11. - 27. 11. zúčastnil konference "Exploring mechanisms in biology - theory and experiment." Konference byla zaměřená na využití výpočetních a simulačních metod ve výzkumu biologických systémů, především na techniky molekulové dynamiky, systémové biologie a nové bioinformatické přístupy. V rámci konference přednesl příspěvek s názvem "Clustering of short peptide sequences to identify protein-interaction consensus motifs in large datasets", v němž představil nový přístup ke shlukovací analýze peptidových sekvencí a využití této výpočetní metody k analýze dat získaných pomocí sekvenování peptidových knihoven s využitím přístupů sekvenování nové generace.

Dále měl Mgr. Krejčí možnost se ve dnech 9. 12. - 11. 12. zúčastnit konference "7th International Peptide Symposium" zaměřené na široké spektrum výpočetních i laboratorních metod zkoumajících a využívajících krátké peptidy v biologických systémech. Příspěvky na konferenci dobře ilustrovaly současný stav výzkumu v oblasti využití krátkých peptidů.

Celkově stáž uvedla Mgr. Krejčího do problematiky simulací s pomocí metod molekulové dynamiky do té míry, že je schopen simulace samostatně provádět. Dále navázal spolupráci se skupinou Dr. Vermy a kromě další práce na zmíněném projektu je v plánu společný výzkum dalších obdobných témat pomocí zmíněných výpočetních metod. Navštívené konference rozšířili jehoznalosti v oblasti využití peptidů a výpočetních metod v bioinformatice a chemoinformatice.
 

CLCC Eugenes Marquis, Université de Rennes, Rennes, Francie

V termínu 29.4.-20.6.2015 proběhla stáž Mgr. Lucie Sommerové na pracovišti výskumné skupiny Oncogenesis, Stress and Signalling, CLCC Eugenes Marquis, Université de Rennes, Francie. Pod vedením dr. Erica Cheveta pokračovala ve studiu funkce proteínu AGR2 v proces epiteliálně-mezenchymální tranzice. Na základě predcházejících získaných výsledků se soustředila na charakterizaci funkčního vztahu proteínu AGR2 a epiteliálneho markeru E-cadherinu. Protein AGR2 je členem rodiny endoplazmatických proteinů, protein disulfid izomeráz (PDIs), jejichž úlohou je vytváření disulfidických mústků a regulace sbalování klientských proteinů do správné konformace. Součástí práce byla analýza vlyvu AGR2 proteinu s wild-type CXXS doménou a s mutantnimi formami této domény (CXXC a AXXS) na expresi E-cadherinu v plicní nádorové buněčné línii A549 a prsní nádorové línii MCF-7. Při práci byli použity molekulárně-biologické a biochemické metody. Přínosem bylo i osvojení si metodiky flowcytometrie a její následné využití při analýze změn v membránové lokalizaci E-cadherinu v buňkách A549 a připravené bunečné línii A549 s umlčenou expresí AGR2.
Zároveň pracovala na projektu, který se zabývá regulací AGR2 dalšími členy PDI rodiny (PDIA3 a PDIA5). 

University of Amsterdam, Amsterdam, Nizozemské královsví

Ve dnech 25.5.-13.6.2015 absolvoval Mgr. Jakub Faktor, Ph.D. stáž v laboratoři prof. Garryho Corthalse na University of Amsterdam, Nizozemské království. Účelom stáže bolo prehĺbenie vedomostí v Bottom-up hmotnostnej spektrometrii proteínov s využitím TripleTOF5600+. Plánovanou súčasťou stáže bola optimalizácia prípravy mikrodisekovaného tkaniva na meranie pomocou TripleTOF 5600+ a meranie zmien expresného profilu proteómu bunečnej línie HEK293 v závislosti na rôznych stresových podmienkach pomocou SWATH. Prínosom stáže bolo rozšírenie vedomostí a kontaktov v oblasti troubleshootingu systému EksigentEkspert nanoLC 425 a TripleTOF 5600+. Počas stáže boli riešené problémy s kalibráciou kvadrupólovej časti Triple TOF 5600+, s čistením prístroja TripleTOF 5600+, s tvorbou SWATH a Shotgun metód, so stabilitou nanospreju, problémy spojené s nereprodukovateľným tlakovým profilom kvapalinovej chromatografie počas analýz, s analytickými kolónami, s reprodukovateľnosťou merania, s kalibráciou analyzátoru doby preletu a s prepojením kapilár. Počas stáže som absolvoval viacero seminárov zameraných na problematiku chromatografickej separácie, kde som získal nové vedomosti o parametroch chromatografických kolón, ktoré ovplyvňujú LC separáciu peptidov v komplexnej vzorke. Prínosné bolo aj oboznámenie sa s procesom plnenia vlastných analytických kolón, kde som sa naučil vytvoriť kapilárnu kolónu s fritou a bol som oboznámený s procesom plnenia kolóny stacionárnou fázou. S prof. dr. Garrym Crothalsom bola prediskutovaná možnosť kombinácie MS metódy SWATH s off-gel elektroforézou alebo izoelektrickou fokusáciou (IEF). Prínosom kombinácie techník by bolo vyššie pokrytie celkového proteómu v analyzovaných vzorkách. Off-gel SWATH prípadne kombinácia IEF so SWATH má potenciál v identifikácii a kvantifikácii nízkoabundantných terapeutických cieľov či biomarkerov nádorových ochorení. Spomínané metódy možno kombinovať.
Počas stáže bola nadviazaná spolupráca RECAMO s laboratóriom prof. dr. Corthalsa. Plánovaná spolupráca sa týka analýzy rôznych nádorových tkanív pomocou proteomických metód, obzvlášť pomocou moderných metód hmotnostnej spektrometrie ako napríklad SWATH na TripleTOF 5600+. Ďalšie podrobnosti spolupráce budú prejednané počas návštevy prof. dr. Corthalsa na RECAMO.

Turku, Finsko

V rámci pracovní stáže v termínu od 17.5.-13.6.2015 v Biotechnologickém centru v Turku ve Finsku se Mgr. Dominika Coufalová pod vedením prof. Petri Kouvonena a prof. Roberta Mouldera účastnila projektu zabývajícího se studiem změn proteomu HeLa buněk v závislosti na podmínkách skladování. K porovnání byly vybrány tři různé způsoby zpracování vzorků. První vzorek obsahoval pelet HeLa buněk, které byly inkubovány přes noc při 4°C v pufru RNALater. Druhý vzorek obsahoval pelet HeLa buněk, které byly inkubovány přes noc při 4°C v PBS. Ve třetím vzorku byly HeLa buňky ošetřeny Denatorem a ve čtvrtém vzorku byly buňky okamžitě zmraženy a použity jako kontrolní vzorek. Náplní mé práce byla příprava všech vzorků pro měření hmotnostním spektrometrem. Tato příprava zahrnovala lýzu buněk, redukci, alkylaci a štěpení proteinů metodou střídání tlaků (PCT – pressure cycle technology). Všechny tyto kroky byly provedeny za pomoci přístroje Barocycler. Získané peptidy byly odsoleny na kolonkách C18. Takto připravené vzorky byly měřeny hmotnostním spektrometrem QExactive v data dependentním (DDA) a data independentním (DIA) módu. Dále bylo náplní práce vygenerování proteinové knihovny a vyhodnocování získaných dat. Proteinová knihovna byla vytvořena s využitím programu Proteome Discoverer z dat z DDA analýzy a byla exportovaná do programu Spectronaut. Raw data z DIA analýzy byla také exportována do programu Spectronaut a prohledána pomocí vytvořené knihovny. Získané výsledky byly dále hodnoceny aplikacemi DAVID, UniProt, Ingenuity pathway analysis (IPA) a String. V rámci pracovní stáže si Mgr. Coufalová osvojila přípravu vzorků metodou střídání tlaků s pomocí přístroje Barocycler. Dále jsem se teoreticky i prakticky seznámila s DDA a DIA analýzou a vyhodnocováním dat získaných z těchto analýz. Velkým přínosem bylo seznámení se se zpracováním dat aplikacemi DAVID, IPA a UniProt. 

Madrid, Španělské království

V termínu 20.5.-11.6.2015 proběhla stáž Mgr. Martina Bartošíka, Ph.D. v laboratoři Elektrochemických biosenzorů profesora J.M.Pingarróna z katedry analytické chemie na Facultad de Ciencias Quimicas, Universidad Complutense de Madrid, ve španělském Madridu. Během svého pobytu se zabýval vývojem tzv. elektrochemických magnetobiosenzorů pro detekci mikroRNA jakožto potenciálních nádorových biomarkerů. Jednalo se zejména o osvojení si nové metodiky, optimalizaci nového protokolu, získání předběžných výsledků a navázání oboustranné spolupráce s touto laboratoří.

Vall d´Hebron Institute of Oncology, Barcelona, Španělské království

V termínu 17. - 30. 5. 2015 absolvovala Mgr. Lucie Koubková stáž v laboratoři Dr. Any Vivancos, Vall d´Hebron Institute of Oncology, Barcelona, Španělsko. Účelem stáže bylo bližší seznámení se s metodou sekvenování nové generace. Technika sekvenování DNA během posledních let zaznamenala velký posun kupředu díky novým sekvenátorům tzv. „druhé generace“ (NGS). Sekvenátory první generace detekovaly DNA baze v řadě jednu po druhé, zatímco sekvenátory druhé generace umožňují masivní paralelní sekvenování, kdy jsou sekvenovány tisíce DNA molekul současně. Díky technologii masivního paralelního sekvenování se významně snížila doba potřebná k přečtení dlouhých DNA sekvencí. Nové technologie sekvenování umožňují určit sekvenci lidského genomu nebo jen jeho vybraných částí za zlomek času (několik týdnů) a za mnohem nižší cenu. Z klinického i výzkumného hlediska mají přístroje NGS velký potenciál. Bezprostřední dopad budou mít tyto technologie při nahrazení nebo doplnění stávajících laboratorních postupů (detekce chromozomálních aneuploidií v DNA plodu, identifikace vzácných genetických variant u nemocí s mendelovskou dědičností, detekce dědičných či somatických mutací v genech spojovaných se vznikem nádorových onemocnění atd.). V současnosti existuje několik platforem, které se liší technikou přípravy knihovny amplikonů, způsobem sekvenování a metodou detekce inkorporovaných nukleotidů. Trhu však nyní dominuje platforma společnosti Illumina. Pod vedením Dr. Any Vivancos jsem byla seznámena s protokolem pro amplikonové (Illumina MiSeq sekvenátor) a exomové sekvenování (Illumina HiSeq2500) pacientských vzorků DNA pocházejících z parafínových bločků. Prakticky si Mgr. Koubková vyzkoušela některé postupy (purifikace pomocí Qiagen kitů v mezikrocích přípravy NGS knihoven, metoda ligace adaptorů pomocí NEBNext ultra kitu, kvantifikace NGS knihovny pomocí Kapa Library quantification kitu). Stáž byla přínosem i z hlediska navázání spolupráce s pracovištěm využívajícím metody NGS v preklinických studiích a pro získání cenných zkušeností pro zavedení těchto metod také na pracovišti RECAMO.

Cardiff, Velká Británie

Ve dnech 10.5.-20.6.2015 se Mgr. Mariana Pjechová zúčastnila pracovní cesty na Cardiff University pod vedením Dr. Petra Tomašeca. Cílem stáže bylo osvojit si teoretické vědomosti a praktické zručnosti rekombinace a imunologické NK buněčné CD107 assaye. Během stáže Mgr. Pjechová pracovala na vytvoření delečního mutanta lidského cytomegaloviru (HCMV ∆ UL146) rekombinací pomocí kazet Rpsl a SacB. Tato práce zahrnovala amplifikaci kazet pomocí PCR, kultivaci bakterií obsahujících plazmid s HCMV genomem, první kolo rekombinace - vložení kazety do požadoveného genu (v místě požadované delece) v plazmidu s HCMV genomem, selekci rekombinantních kolonií a ověření vložení kezety do plazmidu, druhé kolo rekombinace - vložení oliga a teda odstranění kazety, selekci rekombinantních kolonií a ověření delece části genu.
Prakticky si Mgr. Pjechová osvojila metodu imunologické NK buněčné CD107 assaye na K562 buňkách. 

Paříž, Francie

V termínu 18. 5. – 10. 6. 2015 absolvovala stáž Mgr. Eva Růčková, Ph.D. v laboratoři Dr. Robina Fahraeuse, Institut de Génétique Moléculaire, Université Paris 7, Paříž, Francie. Laboratoř se mimo jiné zaměřuje na studium interakcí mezi proteiny a RNA, zejména mechanismu regulace stability mRNA genu TP53 a modulace translace této mRNA. V rámci stáže se prakticky seznámila s technikami analýzy interakcí RNA-protein in vitro metodami PLA (Proximity Ligation Assay) a ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay). Stáž byla přínosem pro prohloubení spolupráce na tomto projektu a pro získání cenných zkušeností pro zavedení metod studia interakcí RNA-protein také na pracovišti RECAMO.

Helsinky, Finsko

V termínu 24.5.-31.5.2015 proběhla stáž MUDr. Ivana Justana, Ph.D. a MUDr. Oldřicha Coufala, Ph.D. na pracovišti The Hospital District of Helsinky and Uusimaa, Helsinky, Finsko. Pracoviště ošetřuje pacienty z Helsinek a blízkého okolí a patří k univerzitním nemocnicím odpovědným za léčbu vážných a vzácných onemocnění (Helsinky University Central Hospital - HUCH). Nachází se zde  Breast Surgery Unit, specializující se na léčbu nádorových onemocnění prsu a na klinický výzkum na toto téma. S Dr. Marjut Leidenius, vedoucím lékařské jednotky, a členy týmu byly diskutovány aktuální otázky klinické praxe a klinického výzkumu na téma chirurgické léčby karcinomu prsu. Lékaři měli možnost vidět doposud nestandardní praktické postupy, zejména lokalizaci nehmatných lézí v prosu pomocí radioaktivních zrn, a diskutovat organizační a technické aspekty onkoplastické chirurgie. Obzvláště inspirující bylo představení návrhu rozsáhlého parametrického operačního protokolu pro usnandnění sběru dat v klinickém výzkumu.

Edinburgh, Velká Británie

V termínu 7.4. - 11.5.2015 absolvoval Mgr. Filip Trčka stáž na University of Edinburgh za účelem detekce a analýzy protein-proteinových (PP) interakcí proteinů chaperonového (Hsp70) a E3 ubikvitin ligázového systému (MDM2). Ke studiu PP interakcí Hsp70-MDM2 bylo použito metod SBP-pull-down. Tato interakce byla studována na pozadí nutlinem indukované stabilizace MDM2 v buňkách s inhibovaným chaperonem Hsp90. Pro kontrolu specificity detekovaných interakcí byly připraveny konstrukty kódující mutantní protein Hsp70: I164D, T204A, D529A, V438F, T204A_V438F a deleční konstrukty del533-543 a del526-543. Vazebná aktivita těchto mutantů byla ověřena pull-downy proteinu MDM2 z lyzátu buněk ovlivněných inhibitotem Hsp90. Tyto výsledky prokázaly změněnou afinitu připravených konstruktů k proteinu MDM2 ve srovnání s wild-type proteinem Hsp70. Následně jsme měřili kinetiku vazby substrátového peptidu FAM-NR ke zmíněným mutantům pomocí fluorescenční polarizace. Tyto experimenty odhalily silně sníženou schopnosti proteinů D529A, V438F a del533-543 vázat modelový hydrofóbní peptid. Metoda kinetické analýzy vazebných schopností chaperonu Hsp70 byla optimalizována a stane se součásti panelu metod používaných na RECAMO pro studium chaperonového systému. Následně byla testovány schopnost ligázy CHIP ubikvitinovat protein p53 ve spolupráci se sadou připravených mutantů Hsp70. Metoda in vitro ubikvitinace bude rovněž implmentována na pracovišti RECAMO. Součástí stáže bylo také studium a praktická ukázka metody krystalizace purifikovaných proteinů v „hanging drop“ komoře. Výsledky dosažené v průběhu stáže budou využity v připravované publikaci o interakci MDM2 a Hsp70 a také posloužily při přípravě publikace o interakci Tomm34-Hsp70, pro niž budou využity připravené mutanty Hsp70. Implemetované metody významně obohatí spektrum proteomických metod na pracovišti RECAMO.

Zürich, Švýcarsko

Ve dnech 26.1.-2.4.2015 realizoval Mgr. Pavel Bouchal, Ph.D. stáž v oblasti cílené proteomiky ve skupině prof. R. Aebersolda, Institute of Molecular Systems Biology (IMSB), ETH Zürich, Švýcarsko. V rámci stáže pracoval na interpretaci dat z proteomických experimentů získaných metodou SWATH, jejich validaci a přípravě k publikaci v rámci spolupráce navázané v roce 2014. Seznámil se s dalšími nejnovějšími metodami v oblasti proteomiky: využití PanHuman library, softwarů Spectronaut, Perseus, mDIA a MSStats pro analýzu SWATH dat, vývoj SRM assays, analýzou SRM dat a dále s analýzou protein-proteinových interakcí s využitím chromatografie na principu molekulového síta. Úspěšně konzultoval celou řadu projektů i dílčích problémů řešených v rámci vedených studentských prací. V rámci stáže se zúčastnil třídenního soustředění IMSB (6.-8.2.2015) zaměřeného na nejnovější příbuzné techniky (elektronová mikroskopie, CRISP/Cas9, protein-proteinové interakce), dále konference Breakthroughs in Cancer research and Therapy a navštívil celou řadu přednášek švýcarských a zahraničních odborníků v rámci interních seminářů ETH. Stáž splnila všechny očekávané cíle.

2014

Edinburgh, Velká Británie

V termínu 20.9 - 2.11.2014 absolvoval Mgr. Michal Ďurech stáž na University of Edinburgh za účelem obohacení dosavadních znalostí v oblasti protein-proteinových interakcí. Ke studiu PP interakcí bylo použito metod ITC (isothermal titration calorimetry) a SEC-MALS (size exclusion chromatography - multi-angle light scaterring), které poskytly detailní náhled do termodynamiky a stechiometrie interakce. Dále bylo cílem cesty zapojení se do nových projektů a tudíž podílení se na nových publikacích. Dosažené výsledky budou využity v připravované publikaci.

Cardiff, Velká Británie

Ve dnech 23.7.2014 až 23.10.2014 sa Mgr. Mariana Pjechová zúčastnila pracovní cesty na Cardiff University. Cílem stáže pod vedením Dr. Petera Tomašce byla práce na projektu, který se zabývá modulací CD58/LFA3 proteinu během infekce buněk lidským cytomegalovirem a obecně rozšíření vědomostí v oblasti práce s viry. Byly sledovány změny exprese CD58/LFA3 proteinu na povrchu buněk infikovaných jednogenovými delečními mutanty HCMV a adenovirovými vektory nesoucími jednotlivé geny ULb regionu pomocí průtokové cytometrie. Výsledky byly dále potvrzovány pomocí western blot analýzy a imunofluorescence, stejně jako funkčními experimenty - NK a T-buněčné assaye. Byl identifikován gen, jehož produkt snižuje expresi CD58/LFA3 proteinu na buněčném povrchu. 

Edinburgh, Velká Británie

V období 28.6. - 26.7.2014 se MUDr. Petr Müller, Ph.D. zúčastnil pracovní stáže v laboratoři Prof. Huppa na Univerzitě v Edinburghu. Cílem této stáže bylo: 1) osvojení technologie klonováních variabilních regionů protilátek v podobě single-chain (ScFv) a konstrukce fágových knihoven exprimujících ScFv; 2) vývoj metodiky pro studium protein-proteinových interakcí pomocí bakteriální two-hybrid technologie; 3) spolupráce na společném projektu využívající sekvenování nové generace (NGS) ke studiu peptidových fágových knihoven. Stáž naplnila původní záměr, osvojené technologie budou využity v rámci výzkumu v RECAMO a získané výsledky součástí připravovaných publikací Centra.

2013

Paříž, Francie

V termínu 24.10. 2013 - 6. 1. 2014 se Anand Ponnuswamy, M.Sc. zúčastnil studijního pobytu v laboratoři Dr. Robina Fahraeuse, Institut de Génétique Moléculaire, Université Paris 7, Paříž, Francie. Výzkumný tým se zabývá identifikací a evaluací nitrobuněčných cílů pro nové typy protinádorové léčbym přičemž mezi hlavní cíle výzkumu patří nádorový supresorový protein p53 a proteiny EBNA1 viru EBV (virus Epstein-Barrové). V průběhu stáže M.Sc. Ponnuswamy analyzoval izoformy proteinů p53 a MDM2 a jejich role v lidských nhádorových buňkách.

Dundee, Velká Británie

Ve dnech 5. – 28. 11. 2013 absolvovala Ing. Petra Dvořáková, Ph.D. pokročilé školení v proteomické laboratoři na University of Dundee pod odborným vedením dr. Douglas Lamont. Po dobu stáže se zabývala kvantitativním vyhodnocováním hmotnostně spektrometrických dat (především SILAC vzorků) pomocí programu MaxQuant a jejich následného zpracování do podoby Volcano grafů. Dále se věnovala hmotnostně spektrometrickému nastavením pokročilých metod, jako jsou metody pro měření TMT vzorků, či pro měření fosforylací ve vzorcích. Účelem stáže bylo také získat praxi s novým ionizačním zdrojem zvaným Easy-spray, konzultace údržby hmotnostního spektrometru typu Orbitrap, předejití kontaminace přístroje, příprava a přečištění vzorků.

Cardiff, Velká Británie

V období 10. 6. – 31. 8. 2013 se Mgr. Eva Růčková zúčastnila stáže na pracovišti Cardiff Institute of Infection and Immunity, University School of Medicine pod vedením Dr. Petera Tomašce. Pracoviště se zabývá studiem lidského cytomegaloviru (HCMV) a jeho interakcemi s buňkami lidského imunitního systému. V průběhu stáže vytvářela panel rekombinantních HCMV (RCMV) s delecemi jednotlivých genů rodiny US12 a rodiny ULb, u kterých se předpokládá funkce důležitá pro modulaci imunitní odpovědi. Tyto RCMV budou využity v proteomických studiích, jejichž výsledky přispějí k odhalení funkcí jednotlivých genů HCMV na průběh infekce. Získaná data budou publikována v odborném časopise s dedikací RECAMO.

Southampton, Velká Británie

Ve dnech 19.5.-1.6.2013 Mgr. Pavel Bouchal, Ph.D. a Mgr. Jakub Faktor uskutečnili stáž na pracovišti hmotnostní spektrometrie University of Southampton, Faculty of Medicine, Velká Británie. V rámci stáže byly měřeny chromatograficky separované peptidové frakce proteinových extraktů ze vzorků od pacientek s karcinomy ovaria připravené v rámci dosavadní spolupráce s dr. S. Garbisem. Byla rovněž prováděna analýza MS dat, jejich interpretace a bioinformatická analýza výsledků, přičemž předběžná data ukazují na velmi kvalitní výsledky. Byly rovněž připravovány podklady pro publikaci.

2012

Dundee, Velká Británie

V termínu 8.10. – 5.12.2012 se Ing. Petra Dvořáková, Ph.D. zúčastnila stáže v proteomické laboratoři na pracovišti v Dundee, College of Live Science; pod odborným vedením Douglas Lamond. V průběhu stáže se seznámila s měřením prováděným na kapalinovém chromatografu Dionex Ultimate 3000 s hmotnostním spektrometrem LTQ Orbitrap Velos,dále pak se základní údržbou přístroje (výměna pufrů, kolony, výměna emiteru, čištění transfer tube a S-lenses), s kalibrací iontové pasti a orbitrapu. Následně se seznámila s metodami, které se v této proteomické laboratoři používají pro měření vzorků. To vše obnášelo získat orientaci v jednotlivých programech jako je Chromeleon, Tune a Xcalibur. Stáž byla zaměřena i na osvojení si technik přípravy vzorků a to především se zaměřením na štěpení proteinu, přípravu fosfoproteinu a FASP protokol. Dále vyhodnocení výsledků pomocí softwaru Proteom Discover. Stáž také posloužila k prohloubení mezi laboratorní spolupráce.

Přihlášení

Přihlášení